mRNA疫苗
mRNA疫苗打破了傳統(tǒng)滅活、減毒疫苗的免疫激活模式，創(chuàng)新性地利用人體本身細胞生產(chǎn)抗原，以此激活特異性免疫。mRNA疫苗的保護率極高，能達到90%。在研發(fā)上，mRNA疫苗能夠快速地更新迭代以應(yīng)對不斷出現(xiàn)的變異毒株，且生產(chǎn)過程短，只需要60-70天。對于新型冠狀病毒疫苗的研制，除了抗原設(shè)計外，選擇合適的載體也是至關(guān)重要的。在疫情影響下，mRNA 疫苗讓科研人員愈發(fā)重視，關(guān)于它的各項研究正在如火如荼地進行中。
爭分奪秒|賽默飛全流程助力mRNA COVID-19疫苗研發(fā)
核酸疫苗-mRNA關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQA
通過工藝開發(fā)和質(zhì)量控制對產(chǎn)品進行描述：為了使疫苗能被監(jiān)管機構(gòu)接受，需要對純度/雜質(zhì)監(jiān)測(CQAs)進行深入的分析表征和確定的標準，以確保安全性和有效性。這意味著雜質(zhì)需要通過表征來理解，定義可接受的水平，然后監(jiān)測安全性和有效性。
行業(yè)領(lǐng)先的mRNA解決方案-加速賦能實現(xiàn)企業(yè)關(guān)鍵性進展
課程一：理想中的二維液相色譜系統(tǒng)——疫苗研究的創(chuàng)新
課程一：理想中的二維液相色譜系統(tǒng)——疫苗研究的創(chuàng)新
Alexander Schwenger 是德國 CureVac AG 的 EPD物理化學(xué)經(jīng)理。 他在斯圖加特大學(xué)獲得博士學(xué)位。
課程二：液相色譜新技術(shù)在核酸疫苗研發(fā)中的應(yīng)用-提純
課程二：液相色譜新技術(shù)在核酸疫苗研發(fā)中的應(yīng)用-提純
課程三：液質(zhì)聯(lián)用平臺在 mRNA 疫苗表征及質(zhì)控中的應(yīng)用
課程三：液質(zhì)聯(lián)用平臺在 mRNA 疫苗表征及質(zhì)控中的應(yīng)用
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程六：液相色譜耗材技術(shù)在基因治療和預(yù)防藥物中的表征
課程六：液相色譜耗材技術(shù)在基因治療和預(yù)防藥物中的表征
只需30秒簡單注冊，即可解鎖上述所有mRNA課程。
目前獲批上市的疫苗佐劑多數(shù)集中在微小顆粒或納米顆粒，包括鋁鹽、乳劑、脂質(zhì)體和病毒載體。
脂質(zhì)體主要由磷酸類脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子夾水結(jié)構(gòu)，可包裹多種疫苗，并有效地將抗原送至細胞對應(yīng)靶點。其作用機制與鋁佐劑相似，具有儲存庫效應(yīng)，并可以增強抗原遞呈細胞（APC）對抗原的攝入。
由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒有紫外吸收，CAD電霧式檢測器較傳統(tǒng)紫外檢測器、ELSD檢測器等有著獨特的優(yōu)勢，分析物既不需要發(fā)色團也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測。
CAD檢測器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現(xiàn)性成為新冠mRNA疫苗質(zhì)量控制的首選。本實驗利用Vanquish Flex液相色譜系統(tǒng)和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測器來分析疫苗中的佐劑。
色譜圖：
系統(tǒng)適用性色譜圖
實驗結(jié)果與討論:
PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2 >0.999。 本方法五種組分檢測限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色譜圖
由實驗結(jié)果可知，本方法利用CAD電霧式檢測器直接檢測疫苗中的脂質(zhì)體載體，無需進行前處理，靈敏度高，分離度和重復(fù)性好。
樣品前處理簡單，樣品經(jīng)純化水稀釋后可直接進樣分析。
制劑樣品色譜圖
新冠疫苗主流研發(fā)工藝
1. 前處理
Nuclease T1是一種真菌核酸內(nèi)切酶，可切割鳥嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強的特異性，常用于核酸測序應(yīng)用。但由于核酸內(nèi)切酶效率很高，酶解時間較難控制，且傳統(tǒng)的溶液酶解方法會使核酸酶殘留在分析柱上造成污染。基于以上需求，賽默飛推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過簡單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實驗的重現(xiàn)性并降低酶的干擾（如下圖）。
有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應(yīng)；b) 采用全自動磁珠純化儀，反應(yīng)、分離及純化均可根據(jù)設(shè)置好的程序進行自動操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。
圖a:手動前處理示意圖
圖b: 全自動化在線前處理示意圖
反應(yīng)條件的優(yōu)化：
a. 反應(yīng)時間：酶解時間控制在5min 內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應(yīng)時間至30min.
b. 反應(yīng)溫度：37℃與50℃的結(jié)果類似
2. 色譜柱
色譜分離采用一款專用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹脂構(gòu)成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對寡核苷酸可實現(xiàn)高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類型號，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號。
圖 A
圖 B
3. 液相系統(tǒng)
核酸樣品吸附性強，而生物惰性液相系統(tǒng)吸附低；其次離子對試劑易腐蝕液相系統(tǒng)管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統(tǒng)。
液相方法如下圖：
4. 質(zhì)譜
新一代Orbitrap Exploris系列產(chǎn)品具有體積小、性能高、操作簡單等優(yōu)勢，擴展了Q Exactive系列質(zhì)譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內(nèi)置的AcquireX數(shù)據(jù)采集工作流程，為各種不同類型的應(yīng)用設(shè)置參數(shù)模板，一鍵調(diào)用，可進行全面自動化的樣品分析；且?guī)в蠩ASY IC離子源內(nèi)標校正，保證儀器的高質(zhì)量精度；更快的掃描模式可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級采用120，000分辨率，二級30，000分辨率；負離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 (優(yōu)化后的能量，適用于mRNA mapping). 該方法模板可一鍵調(diào)用，操作簡便，且得到高質(zhì)量的譜圖。
5. 數(shù)據(jù)分析軟件
Biopharma Finder軟件可實現(xiàn)核酸樣品自動化數(shù)據(jù)分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡便；對二級譜圖進行自動化注釋和解析；寡核苷酸雜質(zhì)定性和相對定量分析；多批次樣品含量變化趨勢比對。圖b 展示定結(jié)果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對應(yīng)的理論及實測二級圖譜，將圖譜里響應(yīng)很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結(jié)果可信度高。
圖 a
圖 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎(chǔ)上增加了長鏈mRNA mapping的功能，在數(shù)據(jù)處理方法中增加核酸酶模塊，有常見的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結(jié)果，對于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細信息，如在序列中的位置、一級和二級譜圖、可信度、定量信息等。對于長度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNAse T1酶解，即可獲得98.5%序列覆蓋度結(jié)果。
得益于Orbitrap儀器采集的高質(zhì)量圖譜，在核酸分析結(jié)果里幾乎每一條鏈都可實現(xiàn)100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對于區(qū)分同分異構(gòu)體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個特定堿基構(gòu)成，在其酶解片段中出現(xiàn)同分異構(gòu)是常見的現(xiàn)象，如下圖，當(dāng)儀器檢測到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構(gòu)的兩條鏈里的每一個堿基，即可輕松區(qū)分兩條分子量相同，序列不同的片段。
對于長鏈RNA片段，如下圖具有13個漏切位點，48個堿基長度的片段，也可鑒定到每一個堿基，得到高可信度結(jié)果。酶解片段越長，其序列特異性越強，對于RNaes T1酶解無法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長片段作為互補信息。
案例分享：
編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對色譜檢測mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺，從前處理到液質(zhì)表征分析，得到如下結(jié)果：圖b顯示mRNA樣品經(jīng)過RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長，具有高特異性；與理論堿基序列匹配，在嚴格的數(shù)據(jù)篩選條件下，可得到98.5%的序列覆蓋度。
圖 a
圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1
圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜核酸分析平臺，可以實現(xiàn)mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質(zhì)鑒定及定量等功能，為疫苗開發(fā)和質(zhì)控提供更精確可靠的數(shù)據(jù)。
參考文獻：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)
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由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒有紫外吸收，CAD電霧式檢測器較傳統(tǒng)紫外檢測器、ELSD檢測器等有著獨特的優(yōu)勢，分析物既不需要發(fā)色團也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測。
CAD檢測器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現(xiàn)性成為新冠mRNA疫苗質(zhì)量控制的首選。本實驗利用Vanquish Flex液相色譜系統(tǒng)和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測器來分析疫苗中的佐劑。
色譜圖：
系統(tǒng)適用性色譜圖
實驗結(jié)果與討論:
PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2 >0.999。 本方法五種組分檢測限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色譜圖
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樣品前處理簡單，樣品經(jīng)純化水稀釋后可直接進樣分析。
制劑樣品色譜圖
新冠疫苗主流研發(fā)工藝
1. 前處理
Nuclease T1是一種真菌核酸內(nèi)切酶，可切割鳥嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強的特異性，常用于核酸測序應(yīng)用。但由于核酸內(nèi)切酶效率很高，酶解時間較難控制，且傳統(tǒng)的溶液酶解方法會使核酸酶殘留在分析柱上造成污染?；谝陨闲枨螅惸w推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過簡單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實驗的重現(xiàn)性并降低酶的干擾（如下圖）。
有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應(yīng)；b) 采用全自動磁珠純化儀，反應(yīng)、分離及純化均可根據(jù)設(shè)置好的程序進行自動操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。
圖a:手動前處理示意圖
圖b: 全自動化在線前處理示意圖
反應(yīng)條件的優(yōu)化：
a. 反應(yīng)時間：酶解時間控制在5min 內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應(yīng)時間至30min.
b. 反應(yīng)溫度：37℃與50℃的結(jié)果類似
2. 色譜柱
色譜分離采用一款專用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹脂構(gòu)成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對寡核苷酸可實現(xiàn)高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類型號，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號。
圖 A
圖 B
3. 液相系統(tǒng)
核酸樣品吸附性強，而生物惰性液相系統(tǒng)吸附低；其次離子對試劑易腐蝕液相系統(tǒng)管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統(tǒng)。
液相方法如下圖：
4. 質(zhì)譜
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圖 a
圖 b
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得益于Orbitrap儀器采集的高質(zhì)量圖譜，在核酸分析結(jié)果里幾乎每一條鏈都可實現(xiàn)100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對于區(qū)分同分異構(gòu)體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個特定堿基構(gòu)成，在其酶解片段中出現(xiàn)同分異構(gòu)是常見的現(xiàn)象，如下圖，當(dāng)儀器檢測到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構(gòu)的兩條鏈里的每一個堿基，即可輕松區(qū)分兩條分子量相同，序列不同的片段。
對于長鏈RNA片段，如下圖具有13個漏切位點，48個堿基長度的片段，也可鑒定到每一個堿基，得到高可信度結(jié)果。酶解片段越長，其序列特異性越強，對于RNaes T1酶解無法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長片段作為互補信息。
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圖 a
圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1
圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜核酸分析平臺，可以實現(xiàn)mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質(zhì)鑒定及定量等功能，為疫苗開發(fā)和質(zhì)控提供更精確可靠的數(shù)據(jù)。
參考文獻：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)